近期，中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室（LMB）/廣東省海洋藥物重點實驗室（LMM）閆巖研究員團隊完成了對真菌來源的quadrane新骨架倍半萜terrecyclic acid的生物合成研究，成果發表在英國皇家化學會旗艦期刊《Chemical Science》上，文章被該刊評為每周亮點論文和2024熱點論文。
倍半萜是萜類化合物中占比最多的一種，分子中含15個碳原子，由三個異戊二烯單元組成鏈狀、環狀等多種骨架結構，分布于植物、昆蟲、微生物等生物中，具有廣泛的生物活性，是醫藥、食品和化妝品研發的重要源泉。Terrecyclic acid是一類由環戊烷駢雙環辛烷組合而成的quadrane倍半萜骨架，經過氧化后修飾而成的一類具有抗菌、抗腫瘤活性天然產物。該類化合物最早發現于土曲霉，后又相繼從不同來源的真菌和柳珊瑚中發現（如圖1）。
圖1?來自真菌（A）和柳珊瑚（B）的天然quadrane倍半萜
由于quadrane骨架的特殊結構與良好的生物學活性，其制備方法的研究受到廣泛關注，其中合成化學家先后開發出20余條合成路線。然而由于該類化合物特殊的結構和成環方式，使得其化學合成步驟多，產率較低，在一定程度阻礙了先導藥物的開發。通過合成生物學方法大量制備quadrane類天然產物，是解決這一問題的有效策略。同位素示蹤實驗表明，quadrane骨架的生物合成可能經歷了兩種完全不同的途徑，即Hirota途徑和Coates途徑。盡管計算化學研究表明后者的可能性更高，但quadrane骨架的生物合成基因與其形成的確切酶學機制仍有待證實（路徑圖1）。
路徑圖1?推測的?β-terrecyclene形成途徑. (A) Hirota途徑?(藍色)和Coates分別由FPP生成的β-terrecyclene。(B) Coates重排形成的 α-terrecyclene。
閆巖研究員團隊通過對真菌基因組的挖掘，發現了該類化合物的生物合成基因簇ter，包括一個萜類環化酶（terpene cyclase，TC）即terA、一個P450氧化基因（terB）、一個短鏈脫氫基因（terC）和一個主要協同轉運因子超家族基因（terD），如圖2A。通過異源表達、體內喂養、體外酶反應等研究，驗證了基因簇中各基因的功能（圖2B-2E），證實了其生物合成途徑：即在環化酶TerA的作用下催化FPP產生化合物25，進而產物25被P450酶TerB羥化和羧基化產生化合物32，最后32被脫氫酶TerC催化形成終產物2，如圖2F。
圖2?抗腫瘤倍半萜terrecyclic acid的生物合成途徑解析?（A）Terrecyclic acid的生物合成基因簇；（B）蛋白TerA在酵母S. cerevisae中的異源表達（i）和體外反應（ii）；（C）基因簇ter在A. nidulans中的異源表達：（i）A. nidulans的空白對照，（ii）基因terAB在A. nidulans中的異源表達，ii）基因terABC在A. nidulans中的異源表達；（D）蛋白TerC的體外反應：（i）蛋白TerC將底物32轉化為2，（ii）煮沸過的TerC對底物32失活，（iii）蛋白TerC對底物33無反應；（E）蛋白TerB的體外反應：（i）微粒體蛋白TerB可以催化底物25轉化為32，（ii）蛋白TerB和TerC可以將25轉化為2；（F）Terrecyclic acid (2)的生物合成途徑。
在發現新型倍半萜環化酶（β-terrecyclene合酶，TerA）可以催化法尼基焦磷酸（FPP）轉化為β-terrecyclene（25）的基礎上，通過對TerA的系列定點突變研究（圖3），結合動力學同位素效應分析（圖4），確證了環化過程為Coates途徑，而非最早提出的Hirota途徑。
圖3?基因terA的點突變、產物及其機制
圖4?突變株TerA-V114A的動力學同位素效應 (A) 通過 [12-2H3]-FPP 的動力學同位素效應區分Hirota和Coates途徑. (B) FPP和[12-2H3]-FPP 為底物比較TerA-V114A產物的動力學同位素效應。
通過以上研究，作者發現了抗菌、抗腫瘤quadrane骨架倍半萜terrecyclic acid的生物合成基因簇，以此為基礎，解析了其通過β-terrecyclene環化酶TerA形成quadrane骨架，繼而氧化、脫氫的后修飾的生物合成過程。Quadrane骨架的形成機制也通過對蛋白TerA的點突變和動力學同位素效應得以證實，從而解決了幾十年來關于該類天然產物生物合成研究的謎團。該研究也為進一步以萜類環化酶TerA為探針，從真菌數據庫中對quadrane類天然產物的發掘奠定了基礎。
以上研究，副研究員宋永相為第一作者，研究員閆巖為通訊作者。由濟南大學的王文貴博士，美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）唐奕（Yi Tang）教授團隊合作完成。
上述研究工作得到了國家重點研發計劃、海南省科技計劃三亞崖州灣科技城科技創新聯合項目、國家自然科學基金、中國科學院王寬誠率先人才計劃“盧嘉錫國際團隊項目”和海南省自然科學基金、廣東特支計劃?“海洋藥物研究開發創新團隊”等的資助。
Chemical Science作為英國皇家化學會資助的旗艦期刊，對各國研究人員在化學領域取得的突破性成果，經評審接收后免費發表，并對全球讀者開放獲取。文章接收后，被Chemical Science評為每周亮點論文（2024 ChemSci Pick of the Week Collection）和2024熱點論文（2024 Chemical Science HOT Article Collection）。
本文鏈接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/sc/d4sc01208a。
文章相關信息：Yongxiang Song,Wengui Wang,Jiafan Yang,De-Wei Gao,John M Billingsley,Songtao Wang,Yiguang Zhu,Junfeng Wang,Jianhua Ju,Yan Yan* and Yi Tang. Chem. Sci.,2024,doi.org/10.1039/D4SC01208A
附件下載：